高通量细胞迁移实验方案：从原理到分析

实验原理

细胞接种准备（一般细胞培养）

1、目的细胞按照标准细胞培养方案在血清培养基中培养

2、检测前一天用无血清培养基（0.2%BSA）

3、在无血清培养基中培养过夜后，吸出细胞培养基，用PBS冲洗

4、加入胰蛋白酶溶液，启动细胞分离

5、将细胞悬液转移至试管中，以350×g离心5分钟

6、将细胞重新放入预热的细胞培养基中

7、将细胞悬浮液稀释至100000个细胞/ml的接种密度

ThinCert^®96孔HTS小室中接种细胞

1、向接收板的每个孔中加入200μl 含或不含化学引诱剂的培养基（在这种情况下，不同浓度的FCS从0.25%到10%）

2、将上述制备的细胞悬液加入膜板各孔中50μl

3、将细胞培养板置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24小时

钙黄绿素染色

1、从接收板各孔中吸出细胞培养基

2、向接收孔中加入150μl 无血清培养基和8μM（在DMSO中稀释）钙黄绿素AM

3、在37°C、5%CO2的细胞培养箱中培养45分钟

分离和检测

4、从膜板和接收板的每个孔中吸出细胞培养基

5、用PBS冲洗两块板的孔

6、向接收板中加入胰蛋白酶溶液，使膜下侧迁移的细胞开始脱离

7、胰蛋白酶溶液孵育10分钟，轻轻摇动

8、将180μl 每孔胰蛋白酶细胞悬浮液转移至黑色96孔微孔板的每孔

9、在激发波长为485nm，发射波长为520nm 的读板器中读取荧光

迁移分析实验流程

定性显微检测

1、从膜板各孔吸出培养基

2、使用预湿棉签，顺时针和逆时针方向轻轻旋转棉签，去除膜上部（顶端）未迁移的细胞。

3、使用绿色通道中的荧光显微镜检测膜下侧迁移细胞的荧光信号。此外，ThinCert^®96孔HTS小室由于其独特的孔结构提供了高透明度。这一特点促进活细胞观察，用于检查细胞形态，评估细胞融合，并以更高的准确性和可靠性进行污染监测。因此，每次实验都伴随着对细胞的连续显微镜监测。

在寻找更好的生物标志物、治疗靶点和药物以干预肿瘤转移、血管生成和炎症性疾病等复杂现象方面，体外细胞迁移实验是不可或缺的工具。它们提供了一个可控的环境来测量细胞迁移和分析不同分子的影响，如生长因子和趋化因子，或候选药物。

在迁移实验中，孔径的精确选择至关重要。孔径必须与所研究细胞的尺寸成比例，既具有足够的限制性以防止细胞被动移动，又具有足够的允许性以促进其主动迁移。下表显示了一般膜孔径选择的建议。