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3D 细胞培养总是困难重重？Greiner 有妙招
人阅读 发布时间：2021-05-18 10:23
尽管标准的 2D 或单层细胞培养对于现代生物学的发展至关重要，但 3D 细胞培养在细胞行为和药物反应方面体现的显著优势使得人们对 3D 细胞培养越来越感兴趣。3D 细胞培养技术的普及也让人们认识到它在优化和分析方面的挑战，这里，我们讨论这些困难，并提出一些有效的解决方案。
—— 细胞球的形成 ——
我们知道，不是所有的细胞都容易形成完美紧实的细胞球，但是，有一些技巧或技术可以帮助细胞球的形成。具体来说，优化细胞的铺板密度，培养基的配方，培养时间或使用 Greiner Bio-one 的磁性 3D 培养技术有助于细胞球的形成。细胞排斥表面培养板有效阻止细胞贴壁，磁性纳米粒子（Nanoshuttle）与成球磁力架共同作用，促进细胞球自发形成。
细胞球的尺寸
细胞球的大小与细胞类型，细胞铺板密度和培养时间等密切相关。当细胞球越大，营养物质和氧气将更难到达细胞球中心，这可能是理想结果也可能是不理想的，根据您的实验而定。优化初始细胞接种密度对细胞球的形成有着至关重要的作用。
初始细胞接种密度对细胞球的大小有关键影响。不同铺板密度形成尺寸不一的细胞球，通常情况下，铺板密度越大，形成的细胞球越大。
图 1：不同密度的 A549 细胞培养 48 小时后形成的细胞球。比例尺 = 500 μm
细胞成球时间
有些种类的细胞容易形成细胞球，可能在数小时内形成球状体，而其他细胞则需要几天。随着时间的推移监测细胞球的形成将有助于确定每种应用的理想培养期。
图 2：Hela 细胞 24 小时内成球过程
图 3：HT-29 细胞 72 小时内成球过程
—— 细胞球处理 ——
换液
细胞球在培养容器中通常不是完全静止的，也不会贴在孔板底部或板壁，这大大增加了换液难度，对此，Greiner Bio-one 的换液磁力架（holding drive）大大便利了这一操作。以 96 孔细胞球生物打印套装（货号：655840）为例，换液磁力架上的一个磁柱以磁性作用吸引 96 孔板上 4 个孔中的细胞球，这使得换液变得十分轻松。
图 4：红色箭头所示为 96 孔板适配的换液磁力架（holding drive）
细胞球转移
有时，由于实验需求，需要将细胞球转移到其他环境中继续培养，做后续实验分析。通常，实验人员直接用吸头吸出细胞球，这不仅容易破坏细胞球结构还不可避免地会吸出培养基，影响后续实验。Greiner Bio-one 的 MagPen 系列产品轻松解决了这一问题。MagPen（货号 657850）可用于转移单个细胞球，Mul-MagPen 可用于转移整板的细胞球。
图 5：用于转移单个细胞球的 MagPen
图 6：24 孔 Mul-MagPen（左）和 96 孔 Mul-MagPen（右）
图 6：24 孔 Mul-MagPen（左）和 96 孔 Mul-MagPen（右）
—— 细胞球分析 ——
细胞球成像
有时，细胞球的形状和大小是评价实验结果的重要指标，因此，对细胞球的观测，成像和测量显得尤为重要。尤其是对于一些高内涵成像，平整度高，均一性好的平底板是当之无愧的优选。对于一些对细胞球进行免疫荧光染色的实验可以选择 Greiner Bio-one 黑色底透平底的微孔板用于镜下观察，μclear 底成像效果好，黑色框架可以有效减少孔与孔之间的信号干扰。
图 1：3T3 细胞 3D 培养 6 小时细胞球 DAPI 染色。比例尺 = 250 μm
对于一些药敏实验，细胞球尺寸的改变也是衡量药效的重要指标，这时，我们需要对整个 96 孔或 384 孔微孔板中的细胞球进行成像分析。为此，Greiner Bio-one 推出了便捷的成像系统，自主研发的 Experiment Assistant 的应用程序结合 iPod 用于成像设置，用户可根据实验需求设定成像时间和拍照间隔，此外，Greiner Bio-one 还研发出了 Bio Assay 程序用于分析图片。
图 2：对整个 96 孔板中的细胞球进行成像分析
图 3：3T3 细胞球对不同浓度全反式视黄酸的响应。黑色比例尺 = 5 mm，白色比例尺 = 250 μm。
—— 共培养 ——
为了研究细胞之间的相互作用，可以利用多种方式将不同类型的细胞一起培养，建立更多的模拟体内环境的体外模型。不同类型的细胞可以同时铺板，可以在不同的时间点加入，也可以分别 3D 成球培养后再共培养，具体取决于实验应用。这里给大家分享几个利用 Greiner Bio-one 的磁性 3D 细胞培养技术实现的共培养实例。
图 4：人胶质母细胞瘤细胞（绿色；GFP 标记）和正常人星形胶质细胞（红色；mCherry 标记）分开成球培养后共培养。监测人胶质母细胞瘤细胞与正常星形胶质细胞之间的对抗，持续 10.5 天。观察到人胶质母细胞瘤细胞对正常人星形胶质细胞组成的球体的侵袭浸润。比例尺 = 200 μm
图 5：3T3-L1 脂肪前体细胞（2.25×105）和 GFP 标记的 bEND.3 内皮细胞（2.5×104）在诱导成脂分化培养基中共培养 14 天后整个组织免疫荧光染色图。红色为围脂滴蛋白，绿色为绿色荧光蛋白，表示脂肪细胞分化成成熟脂滴，聚集在 bEND.3 细胞分化的血管状结构周围。比例尺 = 50 μm
参考文献
[1] Hou, Shurong, Tiriac, et al. Advanced Development of Primary Pancreatic Organoid Tumor Models for High-Throughput Phenotypic Drug Screening[J]. SLAS Discovery Advancing Life Sciences R & D, 2018.
[2] Tseng H , Gage J A , Shen T , et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging[J]. Scientific Reports, 2015, 5:13987.
[3] Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation[J]. Nature Nanotechnology, 2010, 5(4):291-296.
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